DEB ጂን ለመጠገን CRISPR/Cas9 (2025)

ይህ የአንድ አመት ፕሮጀክት ሆሞሎጂ ዳይሬክትድ ጥገና (ኤችዲአር) ኢቢን ለማከም CRISPR/Cas9 የጂን ህክምና ዘዴን ለመጠቀም የመጀመሪያ ማስረጃዎችን አቅርቧል። ተመራማሪዎቹ ዲስትሮፊክ ኢቢ ካላቸው አምስት ሰዎች ከቆዳ ባዮፕሲ በተወሰዱ ህዋሶች HDR ተጠቅመዋል። ሂደታቸው ከተሻሻሉ ቫይረሶች (ቫይራል ቬክተሮች) ይልቅ የኤሌክትሪክ ምት (ኤሌክትሮፖሬሽን) በመጠቀም የጂን አርትዖት ሞለኪውሎችን በቤተ ሙከራ ውስጥ ባሉ ሴሎች ውስጥ አስረክቧል። በሁለት ጉዳዮች ላይ የጄኔቲክ ለውጦችን ውጤታማ በሆነ መንገድ ማረም እንደሚችሉ ተገንዝበዋል, በአንድ በተወሰነ ደረጃ እና በሌሎቹ ሁለቱ ውጤታማ አይደሉም. ይህ ስራ እንደሚያሳየው HDR በ EB የጂን ህክምና ውስጥ ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል ነገር ግን ለእያንዳንዱ ታካሚ በግለሰብ ደረጃ ማመቻቸት ያስፈልገዋል.

የፕሮጀክቱ ሂደት ለESGCT/SITGEC የትብብር ኮንግረስ (ሮም፣ ጣሊያን) 22-25 ኦክቶበር 2024 ቀርቧል። የፖስተር ቁጥር P1008. ፖስተር ይመልከቱ.

በፕሮጀክቱ አጋማሽ ላይ ተመራማሪዎች ከደረሱበት ግጥሚያ ግማሹን በተሳካ ሁኔታ እንደደረሱ ተናግረዋል. የእነሱ ጄኔቲክ 'patches' ከሚጠበቀው በላይ በብቃት እየሰሩ ናቸው ነገር ግን ያነሱ ናቸው። ይህ ማለት ከእነሱ የበለጠ ያስፈልጋቸዋል እና ለፕሮጀክቱ ሁለተኛ አጋማሽ በዚህ ላይ ያተኩራሉ.

መሪ ተመራማሪ፡- ዶ/ር ሰርጂዮ ሎፔዝ-ማንዛኔዳ በጂኖም አርትዖት ላይ ጠንካራ ዳራ ያለው በCIEMAT ተመራማሪ ነው።

ተባባሪ ተመራማሪዎች፡- ዶ/ር ፈርናንዶ ላርቸር በዩኒቨርሲዳድ ካርሎስ III ደ ማድሪድ የባዮኬሚስትሪ ተባባሪ ፕሮፌሰር እና በCIEMAT (Epithelial Biomedicine ክፍል) ክፍል ኃላፊ ናቸው።

አሌክስ ባሶንስ ባስኩናና በCIEMAT የባዮሜዲካል ኢንኖቬሽን ክፍል ኤፒተልያል ባዮሜዲሲን ቡድን ውስጥ የዶክትሬት ተማሪ ነው።

ትብብር: ዶ/ር ፓውላ ሪዮ ከመሠረታዊ ሳይንስ እስከ ክሊኒካዊ ሙከራዎች ድረስ በዘር የሚተላለፉ የደም በሽታዎችን በጂን አርትዖት እና በጂን ሕክምና ላይ በዓለም አቀፍ ደረጃ እውቅና ያለው ባለሙያ ነው።

"ይህ የቫይረስ ያልሆነ የጂን አርትዖት አቀራረብ ሁሉንም የሚታወቁ ሚውቴሽን ለመቅረፍ የሚያስችል መሳሪያን ለማፍራት አነስተኛ ዋጋ ያለው እና ሁሉን አቀፍ ስትራቴጂ ይፈልጋል… ወደፊት በቅድመ ክሊኒካዊ ጥናቶች ጂን "የተጣበቁ" የተስተካከሉ keratinocytes እና የታካሚዎች ፋይብሮብላስትስ ጥቅም ላይ ይውላሉ ባዮኢንጂነሪድ የቆዳ አቻዎችን ለማመንጨት።

- ዶክተር ሰርጂዮ ሎፔዝ-ማንዛኔዳ

የስጦታ ርዕስ፡- የ COL7A1 የቫይረስ ያልሆነ ጂኖም ማረም።

በዚህ ፕሮጀክት ውስጥ፣ በአንድ ነጥብ ሚውቴሽን ብቻ ሳይሆን በአጎራባች ሚውቴሽን ላይ ያተኮረ የጂኖም ኤዲቲንግ ስትራቴጂን እናቀርባለን። ይህ "ጄኔቲክ-ፓቺንግ" በ CRISPR/Cas9 ስርዓት አመቻችቶ በነበረው ተፈጥሯዊ ሆሞሎጅስ ሪኮምቢኔሽን (HR) የዲኤንኤ መጠገኛ ዘዴ ላይ የተመሰረተ ነው። “patches” ትንሽ (300-400 ቤዝ ጥንዶች) ባለ ሁለት መስመር ኤችዲአር ለጋሽ ዲኤንኤ አብነቶችን ይወክላሉ እነዚህም ከጂን ቅደም ተከተሎች የሚዘጋጁ ጥቂት ተከታታይ ኤክስፖኖችን ይሸፍናሉ፣ በዚህ አጋጣሚ ከ COL7A1 ጂን ኢንኮዲንግ አይነት VII collagen ጋር ይዛመዳል። ግባችን (ውጤታማነትን፣ ደህንነትን) መለየት እና የእነዚህን ቴክኖሎጂ አጠቃቀሞች ደረጃውን የጠበቀ ሚውቴሽን ለየብቻ የሚውቴሽን ቡድንን ለመቅረፍ የተወሰኑ ፕላስሶችን በቀላሉ ማግኘት ነው። ለ ex vivo RDEB ታካሚ ሴል ህክምና የቀረበው የቫይረስ ያልሆነ ቴክኖሎጂ በአነስተኛ ወጪ ወደ ክሊኒኩ እንዲተረጎም ያመቻቻል።

ለኢቢ በጣም ተስፋ ሰጪ የሕክምና ዘዴዎች አንዱ CRISPR/Cas9 ቴክኖሎጂዎችን በመጠቀም ጂኖም ማረም ነው። ባለፉት 7 ዓመታት ውስጥ የእኛ ላቦራቶሪ በዚህ መስክ ውጤቶቹን ወደ ክሊኒኩ ለመተርጎም የሚያስችል ጠንካራ የፅንሰ-ሃሳብ መረጃ በማቅረብ ላይ በንቃት እየሰራ ነው። በአውሮፓ መድሀኒት ኤጀንሲ ወላጅ አልባ መድሀኒት ስም ካገኙ ከእነዚህ አቀራረቦች በአንዱ ወደ ክሊኒካዊ አተገባበር ላይ ስንሆን (EU/3/20/2253)የበለጠ ቀልጣፋ፣ ደህንነቱ የተጠበቀ እና ክሊኒካዊ ተዛማጅነት ያላቸውን የጂኖም አርትዖት ስልቶችን መፈለግ እንቀጥላለን።

በዚህ ኘሮጀክት ውስጥ የቫይረስ ቬክተሮችን መጠቀም የማይፈልግ ፈጠራ ያለው የጂን ማስተካከያ ዘዴን ለመፈተሽ እናቀርባለን (ሁሉም እቃዎች በአንድ ኤሌክትሮፖሬሽን የተዋወቁት). ግቡ ይህንን የዘረመል ክልል በCRISPR/Cas9 ቴክኖሎጂ ከቆረጠ በኋላ የተቀየሩ ክልሎችን ለማስተካከል እነዚህን “የዘረመል መጠገኛዎች” መጠቀም ነው። አራት የተለያዩ “patches” ን ነድፈናል፣ ይህ ማለት፣ የዲኤስዲኤንኤ ለጋሾች አብነቶች በተለይ በአቅራቢዎቻችን የባለቤትነት ቴክኖሎጂ (የተቀናጁ የዲኤንኤ ቴክኖሎጂዎች፣ አይዲቲ) ኤችዲአርን ለማበረታታት ተሻሽለዋል። እነዚህ አብነቶች ሁለት ኤክሰኖች እና አካባቢያቸው (73 እና 80፣ እያንዳንዳቸው ሁለት “patches” እያንዳንዳቸው) እና አራት የተለያዩ የመቁረጫ ነጥቦችን (ሁለት ለኤክሶን 73 እና ሁለት ለኤክሶን 80) ይይዛሉ። እነዚህ አብነቶች (ከ300-400 bp አካባቢ) እንዲሁም የጎረቤት ኤክስፖኖችን ይሸፍናሉ።

በ "patches" ውስጥ ያለውን የጥገና መጠን ለመገምገም ዓላማ እናደርጋለን ይህም የሚውቴሽን ቡድኖችን ለመፍታት ያስችለናል ወይም ስርዓቱ በበቂ ሁኔታ የሚሰራ ከሆነ በ "patches" ውስጥ ያሉትን ኤክሰኖች ሙሉ በሙሉ ለማስተካከል ያስችለናል. ይህ ልቦለድ፣ ምንም አይነት ቫይረስ፣ ግላዊ የሆነ የጂን ማስተካከያ ስልት በከፍተኛ ዝቅተኛ ኢኮኖሚያዊ ወጪ ወደ ክሊኒኩ በቀላሉ ሊተረጎም እንደማይችል እናምናለን።

ከስጦታው ግማሹ በተሳካ ሁኔታ ደርሰናል። መጀመሪያ ላይ፣ የእኛ ስትራቴጂ የዲኤንኤ “patches” በመጠቀም ጂኖም እንደገና ለመፃፍ ያለመ ኤክሶን ጥንዶችን ለመሸፈን ነበር (በተለይ ሚውቴሽን በ exon ጥንዶች፡ 72-73፣ 73-74፣ 79-80 እና 80-81)። ነገር ግን፣ የተጠቀምንባቸው የዲ ኤን ኤ ፕላቶች ከጠበቅነው ትንሽ ለየት ያሉ ሆነው ተገኝተዋል። እነዚህ ጥገናዎች ጂኖምን ከ 80% በላይ ቅልጥፍና እንደገና ሊጽፉ ይችላሉ, ይህም ቀደም ሲል ከተዘገበው የበለጠ ነው, ነገር ግን ድርጊታቸው በጠባብ መስኮት ብቻ የተገደበ ነው. ከዚህ አንፃር፣ የኛ ምዕራፍ 2 ስትራቴጂ አሁን ለእያንዳንዱ ኤክስዮን በግለሰብ የDNA ፕላስተር ላይ ያተኩራል። ጤናማ የዲ ኤን ኤ ቅደም ተከተሎችን እንዳናስተካክል ለማረጋገጥ፣ CRISPR/Cas9 “ሞለኪውላር መቆረጥ” የሚውቴት ቅደም ተከተሎችን ብቻ ያነጣጠራል። ይህ ለእያንዳንዱ ሚውቴሽን የተወሰኑ ትንንሽ አር ኤን ኤ ያስፈልገዋል፣ ለእያንዳንዱ ኤክሶን ደግሞ የተለመደ የዲ ኤን ኤ ፕላስተር መጠቀም ይቻላል። (ከጁላይ 2024 ሪፖርት)።

መጀመሪያ ላይ፣ ስልታችን የዲኤንኤ “patches”ን በመጠቀም ጂኖምን እንደገና ለመፃፍ የታለመው የኤክሶን ጥንድ ለመሸፈን፣በተለይ ሚውቴሽንን በ exon ጥንዶች 72-73፣ 73-74፣ 79-80 እና 80-81 ላይ በማነጣጠር ነው። ነገር ግን፣ ጥቅም ላይ የዋሉት የዲኤንኤ ፕላቶች ከምንጠብቀው ነገር ትንሽ ተለያዩ። እንደ ክላሲካል ኤችዲአር ስትራቴጂዎች፣ ይህ አዲሱ የIDT (የተቀናጁ ዲ ኤን ኤ ቴክኖሎጅዎች) ስርዓት ከ30 ኑክሊዮታይድ በላይ የሆኑ ቅደም ተከተሎችን እንደገና መፃፍ ስለማይችል ድርጊቱን በጠባብ መስኮት ይገድባል።

ይህንን ስንመለከት፣ የኛ ምዕራፍ 2 ስትራቴጂ ለእያንዳንዱ ኤክስዮን በግለሰብ የDNA patches ላይ ያተኮረ ነበር። ጤናማ የዲኤንኤ ቅደም ተከተሎች ያልተሻሻሉ መቆየታቸውን ለማረጋገጥ፣ CRISPR/Cas9 “ሞለኪውላር መቆረጥ” የሚያተኩረው የተቀየሩ ቅደም ተከተሎችን ብቻ ነው። ይህ ለእያንዳንዱ ሚውቴሽን የተወሰኑ ትንንሽ አር ኤን ኤዎች ያስፈልገዋል፣ ለእያንዳንዱ ኤክሶን የተለመደ የዲ ኤን ኤ ፕላስተር ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል። በተሳካ ሁኔታ ዲ ኤን ኤውን በከፍተኛ ብቃት (>70%) ከ 2 ከ 5 ሚውቴሽን (ታካሚ 2 እና ታካሚ 73.4) ፣ መካከለኛ ቅልጥፍናን (> 25%) በ 2 ሌሎች (ታካሚ 73.2 እና ታካሚ 2) እና አንድ (5%) (E73.3) አሻሽለነዋል። ምንም እንኳን የተስተካከሉ ክሎኖችን መደርደር የሚቻል ስልት ቢሆንም፣ እነዚህን ክሎኖች ለመተከል መጠቀም ከዝቅተኛ የውጤታማነት መጠን ጀምሮ በክሊኒካዊ ሙከራዎች ውስጥ ቴክኒካዊ ፈተናን ይፈጥራል። ቢሆንም፣ ይህ ስራ ከተለምዷዊው የቫይረስ ቬክተር አሰጣጥ ስርዓት ይልቅ ቫይረስ ያልሆነ HDR አቀራረብን በመጠቀም ለሚውቴሽን c.6041_6042delAG እና c.6100G>A ቢያንስ ሁለት ተስፋ ሰጪ የሕክምና አማራጮችን ይሰጣል። (ከመጋቢት 2025 የመጨረሻ ዘገባ።)